مهم‌ ترین معیارها در انتخاب دستگاه HPLC برای آنالیزهای دقیق

گزیده‌ای از مطلب

در دنیای امروز که کیفیت، ایمنی و دقت در تحلیل مواد شیمیایی به یک ضرورت تبدیل شده، ابزارهای آنالیز دقیق نقشی محوری در علوم مختلف ایفا می‌کنند. از کنترل کیفیت داروها گرفته تا بررسی آلاینده‌های محیطی و آنالیز مواد غذایی، نیاز به روش‌هایی که بتوانند ترکیبات پیچیده را با سرعت و دقت بالا شناسایی و اندازه‌گیری کنند، هر روز بیشتر احساس می‌شود. در این میان، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا HPLC یکی از قدرتمندترین و پرکاربردترین تکنیک‌های تجزیه‌ای است که توانسته جایگاه ثابتی در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، صنعتی و کنترل کیفیت به دست آورد.

HPLC با بهره‌گیری از اصل جداسازی بر پایه تفاوت در برهم‌کنش مولکول‌ها با فاز ثابت و فاز متحرک، قابلیت جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری کمی و کیفی طیف گسترده‌ای از ترکیبات را فراهم می‌کند؛ از مولکول‌های کوچک دارویی گرفته تا پروتئین‌های پیچیده زیستی. برخلاف کروماتوگرافی گازی که نیازمند تبدیل نمونه به حالت گاز است، HPLC مستقیما با محلول‌های مایع کار می‌کند و این ویژگی، آن را برای تحلیل ترکیبات حساس به دما یا غیرفرار به انتخابی ایده‌آل تبدیل کرده است.

در این مقاله اختصاصی از شرکت مهام آزما، اصول کارکرد دستگاه HPLC، مهم‌ترین معیارهای انتخاب این دستگاه، روش‌های اندازه‌گیری کمی و کیفی و توانایی‌های کاربردی آن مورد بررسی قرار می‌گیرد.

 

دستگاه آنالیز HPLC و بررسی آنالیز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

آنالیز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا High Performance Liquid Chromatograph که به آنالیز HPLC معروف است، یکی از پرکاربردترین و سریع‌ترین روش‌های جداسازی محلول‌های مایع است. برخلاف روش کروماتوگرافی گازی که در آن ماده ورودی به ستون جدایش باید به صورت گازی باشد، در کروماتوگرافی مایع، خود محلول مایع می‌تواند مستقیما وارد ستون شود. از این رو برای بررسی محلول‌هایی که فرار نیستند و یا محلول‌هایی که به دما حساس هستند باید از کروماتوگرافی مایع (LC) استفاده کرد. در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) محلول را به همراه یک حلال با یک پمپ فشار بالا وارد ستون جدایش می‌شود.

در آن‌جا با مواد متخلخل و یا لایه‌ای پرشده است. برای عبور دادن محلول از داخل ستون معمولا به فشار زیادی نیاز است از این رو به این روش کروماتوگرافی مایع با فشار بالا نیز گفته می‌شود. درون ستون ترکیبات مختلف با سرعت‌های متفاوتی عبور می‌کنند زیرا میزان چسبندگی، نوع و قدرت پیوندی که هر مولکول با فاز ثابت درون ستون ایجاد می‌کند متفاوت است. به همین دلیل زمانی که طول می‌کشد تا هر مولکول از ستون خارج شود مقداری مشخص است. البته این زمان وابسته به نوع ستون و شرایط آزمایشی است که دستگاه آنالیز HPLC با آن کار می‌کند.

باید برای اطمینان از شناسایی دقیق و اندازه گیری مقدار این ترکیب، نمونه استاندارد و معلوم از این ترکیب تهیه شود و این نمونه یکبار با شرایط محلول اصلی توسط همان دستگاه HPLC و با همان شرایط تست شود.

 

توانایی‌های دستگاه آنالیز HPLC

• جداسازی و شناسایی ترکیبات آلی در نمونه مجهول
• اندازه‌گیری سموم مختلف در محیط
• آنالیز مواد غذایی
• آنالیز کمی و کیفی ترکیبات دارویی
• جداسازی و تشخیص پروتئین‌ها و مولکول‌های زیستی
• کنترل استانداردهای داروها، سموم و مواد غذایی
• تشخیص و شناسایی مایعات غیر فرار
• کاربرد برای اسیدهای آمینه، جداسازی، خالص سازی و شناسایی پروتئین‌ها (همچنین تحقیقات پروتومیک)، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربن‌ها، داروها، ترپنوئیدها، حشره‌کش‌ها، آنتی‌بیوتیکها، استروئیدها، گونه‌های آلی و گروهی از مواد گوناگون معدنی و همچنین در برخی از آزمایش‌های مربوط به تعیین غلظت داروها
• مقایسه ساختارهای پروتئین‌های مختلف
• تعیین ساختار پلیمرها
• راندمان جداسازی بیشتر نسبت به سایر روش‌های کروماتوگرافی

 

مهم‌ترین معیارها در انتخاب HPLC

۱. نوع دتکتور (مهم ترین معیار در انتخاب)

• UV-Vis: ارزان، عمومی، برای ترکیبات کروموفوردار
• DAD/PDA: طیف کامل در هر نقطه، تأیید هویت پیک و بررسی خالص بودن
• فلورسانس: حساسیت بالا (تا ppt) برای ترکیبات فلورسنت
• RI: برای قندها و پلیمرها، اما حساسیت پایین و ناسازگار با گرادیان
• MS: قدرت تفکیک و شناسایی ساختاری، ضروری برای ماتریس‌های پیچیده و آنالیز مقادیر ناچیز

 

۲. دقت و تکرارپذیری پمپ

• پایداری جریان در محدوده ±1%\pm 0.1\%±0.1% RSD و توانایی کار در فشار بالا.
• اگر قرار است روی UHPLC (ستون‌های زیر ۲ میکرون) کار کنید، پمپ باید تا ۱۰۰۰ بار را پوشش دهد؛
• HPLC معمول تا حدود ۴۰۰ بار

 

۳. حجم مرده سیستم (Dwell/Extra-column volume)

هر چه کمتر، پیک‌ها تیزتر و تفکیک بهتر! این پارامتر در آنالیزهای سریع و ستون‌های باریک تعیین‌کننده است و در مقایسه برندها اغلب نادیده گرفته می‌شود.

 

۴. اتوسمپلر

• دقت تزریق (RSD<0.5%\text{RSD} < 0.5\%RSD<0.5%)
• Carryover پایین (زیر ۰.۰۰۵%)
• ظرفیت و امکان کنترل دما برای نمونه‌های ناپایدار

 

۵. کوره ستون با کنترل دقیق دما

پایداری \pm 0.1\,^\circ\mathrm{C}؛ نوسان دما مستقیماً زمان بازداشت را جابه‌جا می‌کند.

 

۶. قابلیت گرادیان

باید به این سوال پاسخ دهید که باینری کافی است یا کواترنری لازم دارید؟

گرادیان با فشار بالا (High-pressure mixing) تکرارپذیرتر است اما هزینه آن هم بسیار بالاست.

 

۷. نرم‌افزار و انطباق مقرراتی

اگر کار دارویی یا کنترل کیفیت است، انطباق با CFR 21 Part 11 و Audit Trail الزامی است. نرم‌افزار ضعیف، سخت‌افزار خوب را بی‌اثر می‌کند.

 

۸. پشتیبانی و قطعات مصرفی

عملا مهم‌تر از مشخصات کاتالوگ: موجودی سیل پمپ، لامپ دتکتور، ستون و سرویس‌ کار مجرب می‌باشد.

 

روش‌ اندازه‌گیری کیفی در آنالیز HPLC

زمانی که طول می‌کشد هر مولکول از ستون دستگاه آنالیز HPLC عبور کند و به آشکارساز برسد، زمان بازداری نامیده می‌شود. زمان بازداری برای هر مولکول مقداری منحصر به فردی است از این رو ابتدا لازم است مقداری از محلول استاندارد (معمولا ترکیب خالص از ماده مورد نظر است) ترکیبی را که به دنبال شناسایی آن هستیم را وارد دستگاه کنیم و زمان بازداری آن را اندازه‌گیری و سپس نمونه‌های مجهول را بررسی کنیم. اگر در نمونه مجهول پیکی با زمان بازداری مشابه مشاهده شود، می‌توان گفت که این پیک مربوط به همان ترکیب استاندارد است.

برای تعیین چندین ترکیب در یک محلول ناشناس باید محلول استاندارد تمام ترکیبات مورد نظر را تهیه کرد. باید توجه داشت که تمام نتایج بدست آمده از مقایسه نمونه مجهول با نمونه‌های استاندارد زمانی ارزشمند است که تمامی آنالیزها با یک دستگاه در شرایط آزمایشگاهی یکسان انجام شود.

 

روش‌های اندازه‌گیری کمی در آنالیز HPLC

در روش‌های اندازه‌گیری کمی نیز مانند روش کیفی نیاز است محلول استاندارد ماده مورد اندازه‌گیری موجود باشد. در ابتدا چند محلول با غلظت‌های مشخص از ماده استاندارد ساخته می‌شود و این محلول‌ها وارد دستگاه آنالیز HPLC می‌شوند. شدت و سطح زیر نمودار مربوط به پیک‌ها اندازه‌گیری می‌شود و سپس نموداری بر حسب غلظت و سطح زیر نمودار (در برخی موارد بر حسب شدت) رسم می‌شود. بر حسب یک معادله خطی می‌توان سطح زیر نمودار ترکیب مورد نظر را به غلظت آن ارتباط داد.

در مواردی که ماتریسی که ماده مورد نظر در آن موجود دارد روی نتایج ‌HPLC اثر گذار است، برای اندازه‌گیری کمی ترکیب مورد نظر، مقادیر مشخصی از ماده استاندارد به نمونه اضافه می‌شود و سپس نمودار مساحت زیر نمودار ماده مورد بررسی بر حسب غلظت ماده استاندارد اضافه شده به نمونه رسم می‌شود. بر اساس نمودار بدست آمده و استفاده از یکسری روابط ریاضی ساده می‌توان غلظت ماده مورد نظر را در نمونه مجهول مشخص نمود.

 

چرا برند Agilent برای آزمایشگاه‌های دارویی و QC محبوب است؟

در آزمایشگاه‌های کنترل کیفیت، تکرارپذیری، صحت و قابلیت استناد نتایج اهمیت زیادی دارد. دستگاه HPLC اجیلنت به دلیل پایداری بالا و امکان کالیبراسیون و نگهداری منظم، در چنین محیط‌ هایی بسیار پرکاربرد است.

در صنایع دارویی، اجیلنت برای موارد زیر انتخاب مناسبی است:

• سنجش خلوص مواد اولیه
• بررسی مقدار ماده موثره
• تعیین ناخالصی‌ها
• آزمون Dissolution
• کنترل کیفیت محصول نهایی
• توسعه و اعتبارسنجی روش

همین ویژگی‌ها باعث شده خرید دستگاه HPLC اجیلنت در بسیاری از شرکت‌های دارویی و آزمایشگاه‌های مرجع یک انتخاب اول باشد.

 

بررسی کلی

دستگاه آنالیز HPLC با ترکیب دقت بالا، تطبیق‌ پذیری گسترده و قابلیت کار مستقیم با نمونه‌های مایع در شرایط متنوع، به ابزاری ضروری در آزمایشگاه‌های مدرن تبدیل شده است. توانایی این تکنیک در جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری کمی طیف وسیعی از ترکیبات (از داروها و سموم گرفته تا پروتئین‌ها، اسیدهای آمینه و آلاینده‌های محیطی) آن را در بسیاری از حوزه‌های علمی و صنعتی بی‌رقیب کرده است.

آنچه در انتخاب و به‌ کارگیری صحیح HPLC تعیین‌ کننده است، تنها مشخصات فنی دستگاه نیست؛ بلکه انتخاب درست دتکتور متناسب با نوع ترکیب هدف، پایداری پمپ، حداقل‌ سازی حجم مرده سیستم، دقت اتوسمپلر و کیفیت نرم‌افزار مدیریت داده، همگی در کنار هم کیفیت نهایی آنالیز را رقم می‌زنند. فراموش نکردن اهمیت پشتیبانی فنی و تأمین قطعات مصرفی نیز از جمله عواملی است که در عمل، عمر مفید و بازدهی واقعی دستگاه را تضمین می‌کند.

با پیشرفت فناوری و ظهور نسل جدید UHPLC و سیستم‌های هیبریدی LC-MS، افق کاربرد این تکنیک روز به روز گسترده‌تر می‌شود. درک عمیق از اصول HPLC و معیارهای انتخاب آن، نه تنها کیفیت آنالیز را بهبود می‌دهد، بلکه در بهینه‌ سازی هزینه‌ها و صرفه‌ جویی در زمان نیز نقش مستقیم دارد.

 

جهت اطلاع از موجودی کالاها و استعلام قیمت با مشاورین فروش شرکت تجهیزات آزمایشگاهی مهام آزما ۰۲۱۸۸۵۰۹۳۸۴ – ۰۲۱۸۶۰۴۵۸۷۰ در ارتباط باشید.