راهنمای کار با دستگاه Real Time PCR و شناخت اجزا و مراحل

آموزش ضروری کار با دستگاه Real-time PCR (qPCR)

دستگاه Real-time PCR (یا PCR کمی/qPCR) یکی از ابزارهای حیاتی و پیشرفته در آزمایشگاه‌های مدرن زیست‌شناسی مولکولی است. این تکنولوژی نه تنها امکان تکثیر قطعات DNA (یا RNA پس از تبدیل به cDNA) را مانند PCR معمولی فراهم می‌کند، بلکه به طور همزمان و در هر چرخه از واکنش، میزان این تکثیر را با استفاده از سیگنال‌های فلورسانس اندازه‌گیری می‌نماید. این قابلیت، qPCR را برای کاربردهایی که نیاز به دقت کمی بالایی دارند، مانند مطالعات بیان ژن یا تشخیص‌های مولکولی، بسیار ارزشمند ساخته است. بهترین دستگاه های RealTime PCR و خرید دستگاه ریل تایم PCR از شرکت مهام آزما با بالاترین کیفیت، جهت دریافت مشاوره خرید تماس حاصل فرمایید.

 

این راهنما به شما کمک می‌کند تا با کلیات مهم اجزای یک دستگاه qPCR و مراحل ضروری کار با آن، از آماده‌سازی تا تحلیل اولیه نتایج، آشنا شوید. همواره به یاد داشته باشید که جزئیات دقیق عملکردی و نرم‌افزاری ممکن است بین دستگاه‌های مختلف و سازندگان متفاوت باشد، لذا مراجعه به دفترچه راهنمای دستگاه اختصاصی خودتان یک اصل ضروری است. مطالب این راهنما بر اساس اصول کلی و پذیرفته‌شده در کار با این تجهیزات است.

 

آشنایی با اجزای کلیدی دستگاه Real-time PCR

یک دستگاه qPCR از بخش‌های اصلی زیر تشکیل شده که هماهنگ با یکدیگر کار می‌کنند:

 

۱. سیستم چرخه حرارتی (Thermal Cycling System)

این بخش، که مشابه دستگاه PCR معمولی است، وظیفه اجرای دقیق و سریع برنامه‌های دمایی را بر عهده دارد:

• بلوک حرارتی (Thermal Block): محفظه‌ای است که تیوب‌ها یا پلیت‌های واکنش PCR در آن قرار می‌گیرند. این بلوک باید بتواند دما را با سرعت و دقت بالا تغییر دهد. معمولاً از المان‌های Peltier برای گرمایش و سرمایش سریع استفاده می‌شود.
• درب حرارتی (Heated Lid): با دمایی بالاتر از دمای واکنش، از تبخیر محلول و ایجاد میعان در بالای تیوب‌ها یا سطح پوشاننده پلیت جلوگیری کرده و حجم واکنش را ثابت نگه می‌دارد.

 

۲. سیستم اپتیکی (Optical System)

این بخش وجه تمایز اصلی دستگاه qPCR با PCR معمولی است و وظیفه تحریک و آشکارسازی سیگنال فلورسانس را دارد:

منبع نور تحریک (Excitation Light Source): نوری با طول موج مشخص برای تحریک رنگ‌های فلورسانس (فلوروفورها) موجود در واکنش تابش می‌کند. امروزه اغلب از LEDهای با طول عمر بالا و پایداری مناسب برای این منظور استفاده می‌شود که می‌توانند طول موج‌های خاصی را برای تحریک فلوروفورهای مختلف تولید کنند.

فیلترهای نوری (Optical Filters): شامل فیلترهای تحریک (که نور تابیده شده از منبع را برای رسیدن به طول موج دقیق تحریک محدود می‌کنند) و فیلترهای نشر (که تنها نور فلورسانس نشر شده از نمونه را عبور داده و سایر نورهای مزاحم را حذف می‌کنند) می‌باشند. این فیلترها برای افزایش دقت و حساسیت آشکارسازی ضروری هستند.

آشکارساز فلورسانس (Fluorescence Detector): شدت نور فلورسانس نشر شده از نمونه‌ها را اندازه‌گیری و آن را به سیگنال الکتریکی تبدیل می‌کند. آشکارسازهای رایج شامل تیوب‌های فتومالتی‌پلایر (PMT) با حساسیت بالا یا دوربین‌های CCD هستند که می‌توانند سیگنال را از تمام خانه‌های یک پلیت به طور همزمان دریافت کنند.

 

۳. کامپیوتر و نرم‌ افزار کنترلی و تحلیلی (Computer and Software)

این بخش به عنوان مرکز فرماندهی دستگاه عمل می‌کند:

کنترل دستگاه: تمامی پارامترهای عملیاتی، از جمله برنامه‌ریزی چرخه‌های حرارتی و تنظیمات سیستم اپتیکی، توسط نرم‌افزار کنترل می‌شود.

جمع‌ آوری داده‌ ها: نرم‌افزار در هر چرخه و در زمان‌های تعیین‌شده، شدت سیگنال فلورسانس را از هر نمونه ثبت می‌کند.

تحلیل اولیه داده‌ ها: ابزارهای پایه‌ای برای تحلیل داده‌های خام فلورسانس، مانند رسم نمودارهای تکثیر، تصحیح خط پایه، تنظیم آستانه، محاسبه چرخه آستانه (Ct/Cq) و انجام آنالیز منحنی ذوب (برای واکنش‌های مبتنی بر رنگ SYBR Green) را فراهم می‌کند.

 

مراحل کلیدی و ضروری کار با دستگاه Real-time PCR

کار با دستگاه qPCR یک فرآیند چند مرحله‌ای است که نیاز به دقت و برنامه‌ریزی دارد:

 

۱) طراحی، آزمایش و آماده‌ سازی واکنش

این مرحله پیش از شروع کار با خود دستگاه انجام می‌شود اما برای موفقیت آزمایش حیاتی است:

• تعیین هدف

مشخص کنید که هدف از آزمایش چیست (مثلا کمی‌سازی مطلق، کمی‌سازی نسبی بیان ژن، یا تشخیص وجود یک توالی خاص)

• طراحی یا انتخاب پرایمر و پروب

پرایمرها باید به طور اختصاصی به توالی هدف متصل شوند و در صورت استفاده از پروب (مانند TaqMan)، پروب نیز باید اختصاصیت بالایی داشته باشد. طراحی نامناسب می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود.

• آماده‌ سازی نمونه

کیفیت DNA یا RNA الگو بسیار مهم است. استخراج و خالص‌سازی صحیح اسید نوکلئیک و در صورت نیاز، سنتز cDNA از RNA، باید با دقت انجام شود.

• تهیه مسترمیکس (Master Mix)

مخلوطی از تمامی اجزای واکنش به جز نمونه الگو (شامل آنزیم پلیمراز، dNTPs، بافر، یون منیزیم، و رنگ فلورسانس یا پروب) تهیه می‌شود. استفاده از مسترمیکس‌های تجاری آماده می‌تواند به کاهش خطا و افزایش تکرارپذیری کمک کند.

• آماده‌ سازی پلیت/تیوب‌ ها

با دقت حجم مشخصی از مسترمیکس و سپس نمونه الگو (یا آب برای کنترل منفی NTC) را به تیوب‌ها یا خانه‌های پلیت PCR اضافه کنید. از ایجاد حباب و آلودگی بین نمونه‌ها جلوگیری کنید.

• در نظر گرفتن کنترل‌ ها

همیشه کنترل‌های مناسبی مانند کنترل بدون الگو (NTC – No Template Control) برای بررسی آلودگی، کنترل مثبت (در صورت امکان) و در مطالعات بیان ژن، ژن‌های مرجع (Reference/Housekeeping genes) را در آزمایش خود بگنجانید.

 

۲) راه‌ اندازی دستگاه و بارگذاری نمونه‌ ها

• دستگاه qPCR و کامپیوتر متصل به آن را روشن کنید.
• نرم‌افزار کنترلی دستگاه را اجرا نمایید.
• پلیت یا تیوب‌های PCR حاوی نمونه‌ها را با دقت و به طور صحیح در بلوک حرارتی دستگاه قرار دهید. از جهت‌گیری صحیح پلیت اطمینان حاصل کنید.
• درب حرارتی دستگاه را محکم ببندید.

 

 

۳) برنامه‌ ریزی پروتکل واکنش در نرم‌ افزار

• یک فایل یا برنامه جدید برای اجرای واکنش ایجاد کنید.

 

• تنظیمات چرخه حرارتی

پارامترهای دمایی و زمانی را برای هر مرحله از واکنش PCR تعریف کنید. یک پروتکل معمول qPCR شامل:

• مرحله واسرشتگی اولیه/فعال‌سازی آنزیم: مثلاً ۹۵ درجه سانتی‌گراد برای ۲ تا ۱۰ دقیقه
• مراحل چرخه‌ای: معمولاً ۳۰ تا ۴۵ چرخه
• واسرشتگی (Denaturation): مثلاً ۹۵ درجه سانتی‌گراد برای ۱۰ تا ۳۰ ثانیه

 

• اتصال پرایمر/طویل‌ سازی (Annealing/Extension)

مثلاً ۵۵ تا ۶۵ درجه سانتی‌گراد برای ۳۰ تا ۶۰ ثانیه. قرائت سیگنال فلورسانس معمولاً در انتهای این مرحله یا طی آن انجام می‌شود. گاهی این دو مرحله (اتصال و طویل‌سازی) دماهای جداگانه‌ای دارند.

• (اختیاری) برنامه آنالیز منحنی ذوب (Melt Curve Analysis)

پس از اتمام چرخه‌ها، برای واکنش‌های مبتنی بر رنگ SYBR Green، جهت بررسی اختصاصیت محصول اجرا می‌شود.

• تعریف چیدمان پلیت (Plate Setup)

در نرم‌افزار، برای هر خانه از پلیت، نام نمونه، نوع نمونه (استاندارد، مجهول، کنترل)، و نوع رنگ فلورسانس مورد استفاده را مشخص کنید.

 

۴) شروع واکنش و پایش همزمان

پس از اطمینان از صحت تمامی تنظیمات، دستور شروع واکنش (Start Run) را از طریق نرم‌افزار صادر کنید.

دستگاه به طور خودکار برنامه حرارتی و اپتیکی را اجرا خواهد کرد. در بسیاری از نرم‌افزارها، می‌توانید نمودارهای تکثیر را به صورت زنده در حین پیشرفت واکنش مشاهده کنید که می‌تواند دید کلی از روند آزمایش به شما بدهد.

 

۵) تحلیل داده‌های اولیه پس از اتمام واکنش

پس از پایان واکنش، نرم‌افزار داده‌های خام فلورسانس را برای تحلیل بیشتر در اختیار شما قرار می‌دهد:

• بررسی کیفیت نمودارهای تکثیر

ابتدا نمودارهای تکثیر تمام نمونه‌ها و کنترل‌ها را بررسی کنید. کنترل NTC نباید هیچ‌گونه تکثیری (سیگنال افزایشی) نشان دهد. کنترل‌های مثبت (در صورت استفاده) باید تکثیر مناسبی داشته باشند.

• تنظیم خط پایه (Baseline) و آستانه (Threshold)

این پارامترها برای محاسبه دقیق مقادیر Ct بسیار مهم هستند. خط پایه نشان‌دهنده سیگنال نویز اولیه است و آستانه، سطحی از فلورسانس است که عبور سیگنال نمونه از آن به عنوان یک تکثیر واقعی در نظر گرفته می‌شود. نرم‌افزارها معمولاً این تنظیمات را به صورت خودکار انجام می‌دهند، اما گاهی نیاز به بررسی و تنظیم دستی توسط کاربر وجود دارد.

• تعیین مقادیر Ct (Cycle Threshold)

مقدار Ct، شماره چرخه‌ای است که در آن، سیگنال فلورسانس نمونه از خط آستانه عبور می‌کند. این مقدار با لگاریتم مقدار اولیه DNA هدف رابطه معکوس دارد (Ct کمتر یعنی مقدار اولیه DNA بیشتر).

• ایجاد منحنی استاندارد (برای کمی‌ سازی مطلق)

اگر در آزمایش خود از رقت‌های سریالی از یک استاندارد با غلظت مشخص استفاده کرده‌اید، نرم‌افزار می‌تواند با رسم مقادیر Ct آن‌ها در برابر لگاریتم غلظت، یک منحنی استاندارد ایجاد کند. پارامترهایی مانند ضریب همبستگی (R2) و بازده واکنش (Efficiency) این منحنی، کیفیت آن را نشان می‌دهند. از این منحنی برای تعیین غلظت نمونه‌های مجهول استفاده می‌شود.

• کمی‌سازی نسبی (مثلاً در مطالعات بیان ژن)

در این موارد، بیان ژن هدف نسبت به یک یا چند ژن مرجع پایدار سنجیده می‌شود (مثلاً با استفاده از روش رایج ΔΔCt).

• آنالیز منحنی ذوب (برای واکنش‌ های SYBR Green)

این آنالیز با افزایش تدریجی دما پس از اتمام PCR و ثبت تغییرات فلورسانس انجام می‌شود. هر محصول DNA دو رشته‌ای در دمای خاصی ذوب (دو رشته از هم جدا) می‌شود. یک پیک منفرد و واضح در نمودار منحنی ذوب، نشان‌دهنده تولید محصول اختصاصی و عدم وجود محصولات جانبی مانند دایمرهای پرایمر است.

 

۶) تفسیر نتایج و گزارش‌ دهی

نتایج کمی به دست آمده (مانند غلظت‌ها یا تغییرات بیان ژن) را در چارچوب سوال اولیه آزمایش خود تفسیر کنید. نتایج را به طور واضح، همراه با مقادیر Ct، اطلاعات مربوط به کنترل‌ها، پارامترهای منحنی استاندارد (در صورت استفاده) و داده‌های منحنی ذوب (در صورت لزوم) گزارش دهید.

 

۷) خاموش کردن دستگاه و نگهداری اولیه

پس از اتمام کار و ذخیره داده‌ها، دستگاه را طبق دستورالعمل سازنده خاموش کنید.

نگهداری منظم از دستگاه، مانند تمیز کردن سطح بلوک حرارتی و انجام بررسی‌های دوره‌ای توصیه شده توسط سازنده (مانند کالیبراسیون اپتیکی در صورت نیاز)، به حفظ عملکرد بهینه و افزایش طول عمر آن کمک می‌کند.

 

❗ نکات مهم و ضروری

• کیفیت نمونه اولیه (DNA/RNA): خلوص و عدم تخریب اسید نوکلئیک اولیه، تأثیر بسیار زیادی بر نتایج qPCR دارد.
• طراحی دقیق پرایمر/پروب: برای اطمینان از اختصاصیت و کارایی واکنش، این مرحله بسیار حیاتی است.
• جلوگیری از آلودگی: همواره از نوک سمپلرهای فیلتردار استفاده کنید، در محیطی تمیز کار کنید و در صورت امکان، مراحل مختلف آماده‌سازی واکنش را در فضاهای جداگانه انجام دهید تا از آلودگی (به‌ویژه آلودگی با محصولات PCR قبلی) جلوگیری شود.

 

خلاصه مقاله و نتیجه‌ گیری

دستگاه Real-time PCR یک تکنولوژی پیچیده اما با آموزش و دقت کافی، قابل استفاده است. درک صحیح از اجزای دستگاه و تسلط بر مراحل مختلف کار با آن، از طراحی آزمایش گرفته تا تحلیل دقیق داده‌ها، کلید دستیابی به نتایج کمی قابل اعتماد و معنادار در پژوهش‌های مولکولی و کاربردهای تشخیصی است. این ابزار قدرتمند، همچنان به پیشرفت خود ادامه داده و نقش مهمی در توسعه علوم زیستی و پزشکی ایفا می‌کند.

 

جهت اطلاع از موجودی کالاها و قیمت ها با مشاورین فروش شرکت تجهیزات آزمایشگاهی مهام آزما ۰۲۱۸۸۵۰۹۳۸۴ – ۰۲۱۸۶۰۴۵۸۷۰ در ارتباط باشید.