راهنمای ضروری کار با دستگاه LC-MS/MS و اجزای آن

دستگاه کروماتوگرافی مایع-طیف‌ سنجی جرمی متوالی LC-MS/MS چیست؟

دستگاه کروماتوگرافی مایع-طیف‌ سنجی جرمی متوالی، یا به اختصار LC-MS/MS، یک ابزار تحلیلی بسیار قدرتمند و پیشرفته است که یک قدم فراتر از دستگاه LC-MS معمولی می‌ رود. جهت خرید دستگاه LC-MS کلیک نمایید. این تکنیک به ما اجازه می‌ دهد تا با دقت و حساسیت بسیار بالایی، مولکول‌ های خاصی را در نمونه‌ های پیچیده شناسایی، ساختار آن‌ ها را بررسی و مقدارشان را اندازه‌ گیری کنیم. این راهنما، نگاهی کلی به اجزای اصلی این دستگاه و اصول کار با آن دارد.

 

یک مرحله “MS” اضافه؛ قدرت تشخیص بیشتر

در دستگاه LC-MS، بخش کروماتوگرافی مایع (LC) ابتدا مواد را جدا می‌ کند و اولین طیف‌ سنج جرمی (MS) جرم آن‌ ها را مشخص می‌ کند. اما گاهی اوقات، این اطلاعات برای شناسایی قطعی یک ماده یا تشخیص آن از مواد بسیار مشابه کافی نیست.

LC-MS/MS با اضافه کردن یک مرحله دیگر از طیف‌ سنجی جرمی، این امکان را فراهم می‌ کند که یون‌ های خاصی را انتخاب کرده، آن‌ ها را به قطعات کوچکتر بشکنیم و سپس این قطعات را بررسی کنیم.

 

این کار مانند این است که پس از شناسایی اولیه یک شیء، آن را باز کنیم تا اجزای داخلی‌ اش را ببینیم و به درک عمیق‌ تری از آن برسیم. این فرآیند به ما کمک می‌ کند تا با اطمینان بیشتری ساختار مولکول را شناسایی کرده و یا اندازه‌ گیری بسیار دقیقی از آن در نمونه‌ های بسیار پیچیده داشته باشیم.

 

اجزای اصلی دستگاه LC-MS/MS

یک سیستم LC-MS/MS از چندین بخش کلیدی تشکیل شده است:

۱. بخش کروماتوگرافی مایع (LC) و منبع یون

این بخش کاملا مشابه دستگاه LC-MS معمولی است. بخش LC (شامل پمپ، سیستم تزریق نمونه، ستون جداسازی و آون ستون) وظیفه جداسازی فیزیکی ترکیبات موجود در نمونه را بر عهده دارد. پس از جداسازی، ترکیبات وارد منبع یون (Ion Source) می‌ شوند (مانند الکترواسپری یا ESI) که در آنجا مولکول‌ ها به ذرات باردار یا همان یون تبدیل می‌ شوند تا بتوانند توسط بخش طیف‌ سنج جرمی شناسایی شوند.

 

۲. طیف‌سنج جرمی متوالی (The Tandem Mass Spectrometer –  قلب تپنده  MS/MS)

اینجاست که تفاوت اصلی با LC-MS معمولی آشکار می‌ شود. این بخش معمولا از سه قسمت اصلی پشت سرهم تشکیل شده است:

• آنالایزر جرمی اول (MS1)

پس از اینکه یون‌ ها از منبع یون خارج شدند، وارد این بخش می‌ شوند. وظیفه MS1 این است که از میان تمام یون‌ های ورودی، فقط یون خاصی را که ما به دنبال آن هستیم (به آن “یون پیش‌ ساز“ یا “یون والد” می‌ گوییم) بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) آن انتخاب و جدا کند و به بقیه یون‌ ها اجازه عبور ندهد. دستگاه‌ های چهارقطبی (Quadrupole) معمولا به عنوان MS1 استفاده می‌ شوند.

• سلول برخورد (Collision Cell)

یون پیش‌ ساز انتخاب شده توسط MS1، وارد این سلول می‌ شود. در اینجا، این یون با مولکول‌ های یک گاز خنثی (مانند گاز آرگون یا نیتروژن) که به طور کنترل شده وارد سلول شده‌ اند، برخورد می‌ کند. این برخوردها باعث می‌ شود یون پیش‌ ساز انرژی گرفته و به قطعات کوچکتر و باردار دیگری به نام “یون‌ های محصول“ یا “یون‌ های قطعه” شکسته شود. این فرآیند معمولا تجزیه ناشی از برخورد (Collision-Induced Dissociation – CID) نامیده می‌ شود. انرژی برخورد یک پارامتر مهم است که توسط کاربر تنظیم می‌ شود و بر الگوی شکست تأثیر می‌ گذارد.

• آنالایزر جرمی دوم (MS2)

تمام یون‌ های محصول (قطعات) که در سلول برخورد ایجاد شده‌ اند، وارد این بخش می‌ شوند. وظیفه MS2 این است که این یون‌ های محصول را بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) آن‌ ها از هم جدا کرده و به سمت آشکارساز هدایت کند. این بخش نیز می‌ تواند یک چهارقطبی، یک آنالایزر زمان پرواز (Time-of-Flight – TOF) یا انواع دیگری از آنالایزرهای جرمی باشد.

 

۳. سایر اجزا

• آشکارساز (Detector)

یون‌ های محصول جدا شده توسط MS2 به آشکارساز می‌ رسند (یک ضرب‌ کننده الکترونی) و سیگنال الکتریکی متناسب با تعدادشان تولید می‌ کنند.

• سیستم خلاء (Vacuum System)

برای عملکرد صحیح تمام بخش‌ های طیف‌ سنج جرمی دستگاه LC-MS/MS، وجود یک محیط خلاء بالا ضروری است تا از برخورد ناخواسته یون‌ ها با مولکول‌ های هوا جلوگیری شود.

• کامپیوتر و نرم‌ افزار (Computer and Software)

این بخش تمامی عملکردهای دستگاه LC-MS/MS را کنترل می‌ کند، از جمله تنظیمات بخش LC، منبع یون، پارامترهای MS1، سلول برخورد (نوع گاز، فشار، انرژی برخورد) و MS2. همچنین وظیفه جمع‌ آوری داده‌ ها، پردازش آن‌ ها و کمک به تفسیر نتایج را بر عهده دارد.

 

اصول کار با LC-MS/MS و حالت‌ های اسکن کلیدی

کار با دستگاه LC-MS/MS نیازمند درک درستی از نحوه عملکرد و انتخاب حالت‌ های اسکن مناسب است:

۱. آماده‌ سازی نمونه و راه‌ اندازی اولیه

این مراحل شبیه به LC-MS است، اما اغلب برای آنالیزهای MS/MS، به‌ ویژه برای کمی‌ سازی دقیق یا مطالعات ساختاری، نمونه‌ ها باید با دقت بیشتری آماده و خالص‌ سازی شوند تا از تداخلات و سرکوب یونیزاسیون جلوگیری شود. هدف از آزمایش (شناسایی ساختار، اندازه‌ گیری مقدار و…) باید از ابتدا مشخص باشد.

۲. حالت‌ های اسکن کلیدی در MS/MS

نرم‌ افزار دستگاه LC-MS/MS به شما اجازه می‌ دهد تا حالت‌ های مختلفی را برای عملکرد MS1 و MS2 انتخاب کنید. انتخاب حالت مناسب بستگی به هدف آزمایش شما دارد:

• اسکن یون محصول (Product Ion Scan – PIS)

در این حالت، شما MS1 را طوری تنظیم می‌ کنید که فقط یک یون پیش‌ ساز با m/z مشخص را انتخاب کند. این یون سپس در سلول برخورد شکسته شده و MS2 تمام یون‌ های محصول حاصل از این شکست را اسکن و شناسایی می‌ کند. این روش برای مطالعه الگوی شکست یک یون خاص و به دست آوردن اطلاعات درباره ساختار آن بسیار مفید است.

• اسکن یون پیش‌ ساز (Precursor Ion Scan – PrIS)

در این حالت، MS1 طیف وسیعی از یون‌ های پیش‌ ساز را یکی پس از دیگری انتخاب و به سلول برخورد می‌ فرستد، اما MS2 طوری تنظیم می‌ شود که فقط یک یون محصول خاص با m/z مشخص را آشکارسازی کند. این روش برای یافتن تمام مولکول‌ هایی در نمونه شما که یک قطعه مشترک خاص را در ساختار خود دارند (و پس از شکست آن را تولید می‌ کنند) استفاده می‌ شود.

• اسکن از دست دادن خنثی (Neutral Loss Scan – NLS)

در این حالت، هم MS1 و هم MS2 طیف وسیعی از m/zها را اسکن می‌ کنند، اما همیشه یک اختلاف جرم ثابت (Offset) بین m/z اسکن شده توسط MS1 و MS2 حفظ می‌ شود. این روش برای شناسایی تمام مولکول‌ هایی که در سلول برخورد یک قطعه خنثی و بدون بار با جرم مشخص (مانند مولکول آب، آمونیاک یا دی‌ اکسید کربن) را از دست می‌ دهند، کاربرد دارد.

• پایش واکنش انتخابی/چندگانه (Selected Reaction Monitoring – SRM / Multiple Reaction Monitoring – MRM)

این حالت یکی از قدرتمندترین و پرکاربردترین حالت‌ های LC-MS/MS برای اندازه‌ گیری کمی بسیار دقیق و اختصاصی مواد است. در SRM، شما MS1 را طوری تنظیم می‌ کنید که فقط یون پیش‌ ساز مربوط به ماده هدف شما را انتخاب کند و MS2 را نیز طوری تنظیم می‌ کنید که فقط یک یا چند یون محصول بسیار خاص و مشخص از آن یون پیش‌ ساز را پایش کند.

چون این “گذار” (Transition) از یک یون پیش‌ ساز به یک یون محصول خاص، بسیار اختصاصی است، این روش حساسیت فوق‌ العاده‌ ای دارد و می‌ تواند مقادیر بسیار ناچیز از یک ماده را حتی در نمونه‌ های بسیار پیچیده (مانند خون یا مواد غذایی) با دقت بالایی اندازه‌ گیری کند. MRM حالت پیشرفته‌ تر SRM است که امکان پایش همزمان چندین گذار مختلف (برای چندین ماده یا چندین قطعه از یک ماده) را فراهم می‌ کند.

 

۳. تفسیر اولیه داده‌ ها

• در اسکن یون محصول، الگوی شکست به دست آمده (یون‌ های محصول و فراوانی نسبی آن‌ ها) با الگوهای موجود در پایگاه‌ های داده طیفی یا با الگوهای پیش‌ بینی شده برای ساختارهای مختلف مقایسه می‌ شود.
• در SRM/MRM، شدت سیگنال مربوط به هرگذار (یون پیش‌ ساز به یون محصول) برای هر نمونه اندازه‌ گیری شده و با استفاده از یک منحنی کالیبراسیون (که با استانداردهایی با غلظت مشخص تهیه شده)، غلظت ماده هدف در نمونه مجهول محاسبه می‌ شود.

 

چرا LC-MS/MS اینقدر قدرتمند است؟

تکنیک LC-MS/MS به دلیل ترکیب جداسازی عالی LC با قدرت تشخیص و تفکیک دو مرحله‌ ای MS، مزایای قابل توجهی دارد:

• گزینش‌ پذیری بسیار بالا

توانایی انتخاب یون پیش‌ ساز و سپس پایش یون‌ های محصول خاص، امکان تشخیص یک ماده را حتی در حضور مقادیر زیادی از مواد دیگر فراهم می‌ کند.

• حساسیت فوق‌ العاده

به‌ ویژه در حالت SRM/MRM، می‌ توان مقادیر بسیار کم از یک آنالیت را اندازه‌ گیری کرد.

• ارائه اطلاعات ساختاری

از طریق تحلیل الگوهای شکست، می‌ توان به اطلاعاتی درباره ساختار مولکول‌ ها دست یافت.

• کمی‌ سازی دقیق و قابل اعتماد

به‌ ویژه در ماتریکس‌ های پیچیده که سایر روش‌ ها ممکن است دچار مشکل شوند.

این ویژگی‌ ها باعث شده LC-MS/MS در حوزه‌ های مختلفی مانند داروسازی (کشف و توسعه دارو، مطالعات متابولیسم و فارماکوکینتیک)، علوم زیستی (پروتئومیکس و متابولومیکس)، آنالیز مواد غذایی و محیط زیست (شناسایی سموم، آلاینده‌ ها و باقیمانده داروها)، پزشکی قانونی و سم‌ شناسی و تشخیص بالینی (مانند غربالگری بیماری‌های متابولیک در نوزادان) کاربردهای گسترده‌ ای داشته باشد.

 

نتیجه‌ و خلاصه

دستگاه LC-MS/MS یک ابزار تحلیلی بسیار پیشرفته و همه‌ کاره است که اطلاعات عمیق و دقیقی از نمونه‌ های پیچیده در اختیار ما قرار می‌ دهد. اگرچه کار با آن ممکن است در ابتدا پیچیده به نظر برسد، اما با درک صحیح از اجزای آن، اصول عملکرد و حالت‌ های مختلف اسکن، می‌ توان از پتانسیل عظیم این تکنیک برای حل چالش‌ های تحلیلی دشوار بهره برد.

 

جهت اطلاع از موجودی کالاها و قیمت ها با مشاورین فروش شرکت تجهیزات آزمایشگاهی مهام آزما ۰۲۱۸۸۵۰۹۳۸۴ – ۰۲۱۸۶۰۴۵۸۷۰ در ارتباط باشید.