راهنمای تفسیر طیف دستگاه LC-Mass بطور کامل

راهنمای روان و کاربردی برای تفسیر طیف LC-MS

دستگاه LC-MS مانند یک آزمایشگاه کوچک و هوشمند عمل می‌ کند که دو کار مهم انجام می‌ دهد:

ابتدا در بخش کروماتوگرافی مایع (LC)، مواد مختلف یک نمونه را از هم جدا می‌ کند و سپس در بخش طیف‌ سنجی جرمی (MS)، هر ماده جدا شده را شناسایی کرده و اطلاعاتی درباره جرم و ساختار آن به ما می‌ دهد. فهمیدن زبان این دستگاه به ما کمک می‌ کند تا رازهای نمونه‌ های شیمیایی را کشف کنیم. با خرید دستگاه LC-MS مناسب می توانید تمامی این تجارب را کسب نمایید.

 

۱. خواندن “برنامه زمانی خروج” از کروماتوگرام (LC)

اولین اطلاعاتی که از دستگاه LC-MS به دست می‌ آوریم، نموداری به نام کروماتوگرام است. این نمودار را می‌ توانیم مانند یک “برنامه زمانی خروج” مواد مختلف از ستون جداسازی LC در نظر بگیریم. در این نمودار، پاسخ آشکارساز (معمولا شدت کل یون‌ های شناسایی شده) برحسب زمان نمایش داده می‌ شود.

 

به این موارد در کروماتوگرام توجه کنید:

• زمان بازداری (Retention Time یا tR)

هر ماده‌ ای که از ستون LC عبور می‌کند، یک “زمان خروج” مشخص دارد. این زمان، تحت شرایط آزمایش یکسان (نوع ستون، حلال‌ ها، سرعت جریان و دمای ستون)، تقریبا برای آن ماده ثابت است و می‌ تواند در شناسایی اولیه آن کمک‌ کننده باشد، به خصوص اگر نمونه استانداردی از آن ماده را نیز آنالیز کرده باشید.

• پیک‌ ها (Peaks)

هر قله یا “پیک” که در کروماتوگرام مشاهده می‌ کنید، نشان‌ دهنده یک ماده (یا گاهی چند ماده که همزمان از ستون خارج شده‌ اند) است. شکل این پیک‌ ها نیز مهم است؛ پیک‌ های تیز، باریک و متقارن عموما نشان‌ دهنده جداسازی خوب و کارایی بالای ستون هستند.

• کروماتوگرام یون کل (TIC – Total Ion Chromatogram)

این نمودار، یک تصویر کلی از تمام موادی است که در نمونه شما توانسته‌ اند یونیزه شده و توسط بخش MS شناسایی شوند. با انتخاب کردن هر پیک خاص در نمودار TIC، می‌ توانید به اطلاعات جرمی دقیق‌ تر مربوط به همان ماده دسترسی پیدا کنید.

 

۲. رمزگشایی “اثر انگشت جرمی” از طیف جرمی (MS)

پس از اینکه یک پیک مورد نظر را در کروماتوگرام LC انتخاب کردید، نوبت به بررسی دقیق‌ تر “اثر انگشت جرمی” آن ماده می‌ رسد که توسط بخش MS دستگاه ارائه شده است. طیف جرمی، نموداری است که نشان می‌ دهد ذرات باردار حاصل از آن ماده (که به آن‌ ها یون می‌ گوییم) چه نسبت جرم به بار الکتریکی (m/z) دارند و فراوانی یا تعداد هر کدام از این یون‌ ها چقدر است. این بخش از داده‌ ها، اطلاعات کلیدی برای شناسایی ساختار ماده را در خود نهفته دارد.

الف) پیدا کردن وزن مولکولی (شناسایی یون اصلی)

در روش‌ های یونیزاسیون رایج در LC-MS، مانند روش الکترواسپری (ESI)، مولکول‌ های ماده مورد نظر ما به طور مستقیم به صورت یون دیده نمی‌ شوند. به جای آن، اغلب با به دست آوردن یک ذره باردار کوچک مانند یک پروتون (که همان هسته اتم هیدروژن و دارای بار مثبت است) یا با از دست دادن آن، به یون تبدیل می‌ شوند.

1. اگر دستگاه شما در حالت تشخیص یون‌ های مثبت تنظیم شده باشد، به احتمال زیاد یونی را خواهید دید که متشکل از “مولکول به همراه یک پروتون اضافه شده“ است.
2. اگر دستگاه در حالت تشخیص یون‌ های منفی باشد، معمولا یونی را مشاهده می‌ کنید که به صورت “مولکول با از دست دادن یک پروتون“ شکل گرفته است.

مقدار نسبت جرم به بار (m/z) این یون‌ های اصلی (که به آن‌ ها یون‌ های شبه‌ مولکولی هم می‌ گویند) به شما کمک می‌ کند تا وزن مولکولی (MW) ماده اولیه را با دقت خوبی محاسبه کنید. برای مثال، اگر در حالت مثبت، پیکی با مقدار m/z برابر با ۳۲۵.۲ مشاهده کنید که مربوط به “مولکول به همراه یک پروتون اضافه شده” است، وزن مولکولی ماده اصلی شما حدوداً ۳۲۵.۲−۱.۰=۳۲۴.۲ واحد جرمی اتمی (دالتون) خواهد بود (چون جرم یک پروتون تقریبا ۱ دالتون است).

 

 

ب) شناسایی “همراهان مولکول” (یون‌ های ادکت یا Adducts)

گاهی اوقات، مولکول ماده‌ شما در طی فرآیند یونیزاسیون، به جای یک پروتون، به یون‌ های دیگری که به طور معمول در حلال‌ ها یا نمونه‌ ها وجود دارند (مانند یون سدیم یا یون پتاسیم که هر دو بار مثبت دارند) متصل می‌ شود. در این حالت، یون‌ هایی مانند “مولکول به همراه یک یون سدیم“ یا “مولکول به همراه یک یون پتاسیم“ در طیف جرمی شما ظاهر می‌ شوند.

مقدار m/z این “یون‌ های همراه” یا ادکت‌ ها، از مقدار m/z یونی که فقط یک پروتون اضافه شده دارد، بیشتر خواهد بود (برای مثال، یون سدیم حدود ۲۳ واحد جرمی و یون پتاسیم حدود ۳۹ واحد جرمی به وزن مولکول اضافه می‌ کنند). تشخیص صحیح این ادکت‌ ها به شما کمک می‌ کند تا وزن مولکولی ماده اصلی را با اطمینان بیشتری تأیید کنید.

 

پ) الگوهای ایزوتوپی (بارکدهای طبیعی در طیف شما)

بیشتر عناصر شیمیایی در طبیعت فقط به یک شکل با یک وزن اتمی مشخص وجود ندارند، بلکه دارای چندین “ایزوتوپ” هستند. ایزوتوپ‌ ها، اتم‌ های یک عنصر یکسان هستند که تعداد پروتون‌ های برابر اما تعداد نوترون‌ های متفاوت دارند، و در نتیجه وزن اتمی آن‌ ها کمی باهم فرق می‌ کند. به عنوان مثال:

• کربن: شکل اصلی آن کربن-۱۲ است، اما همیشه مقدار بسیار کمی از ایزوتوپ سنگین‌ تر آن یعنی کربن-۱۳ نیز درکنار آن وجود دارد.
• کلر: دارای دو ایزوتوپ اصلی است: کلر-۳۵ و کلر-۳۷. ایزوتوپ کلر-۳۷ دو واحد جرمی از کلر-۳۵ سنگین‌ تر است و فراوانی طبیعی کلر-۳۵ تقریبا سه برابر کلر-۳۷ است.
• برم: دو ایزوتوپ اصلی دارد: برم-۷۹ و برم-۸۱. این دو ایزوتوپ نیز دو واحد جرمی از هم تفاوت وزن دارند و فراوانی طبیعی آن‌ ها تقریباً باهم برابر است.

حضور همین ایزوتوپ‌ های مختلف باعث می‌ شود که هر یون در طیف جرمی به صورت یک “خوشه ایزوتوپی“ (یعنی مجموعه‌ ای از چند پیک نزدیک به هم با ارتفاع‌ های متفاوت) دیده شود. پیک اصلی در این خوشه مربوط به یونی است که تنها شامل فراوان‌ ترین و سبک‌ ترین ایزوتوپ‌ های هر عنصر سازنده‌ اش می‌ باشد. پیک‌ های بعدی (که با M+1 ،M+2 و… نشان داده می‌ شوند) به دلیل حضور ایزوتوپ‌ های سنگین‌ تر در ساختار مولکول ظاهر می‌ شوند.

 

الگوی این خوشه‌ های ایزوتوپی (یعنی فاصله پیک‌ها از هم و ارتفاع نسبی آن‌ ها) مانند یک بارکد طبیعی برای شناسایی عناصر موجود در مولکول عمل می‌ کند:

• اگر مولکول شما حاوی یک اتم کلر باشد، یک پیک اصلی و یک پیک دیگر در فاصله دو واحد جرمی بالاتر (مربوط به ایزوتوپ سنگین‌ تر کلر) با ارتفاعی حدود یک‌ سوم پیک اصلی مشاهده خواهید کرد.
• اگر مولکول شما حاوی یک اتم برم باشد، دو پیک اصلی با فاصله دو واحد جرمی از هم (مربوط به دو ایزوتوپ اصلی برم) با ارتفاع تقریبا برابر خواهید دید. بررسی دقیق این الگوها، بخصوص اگر دستگاه شما جرم را با دقت بالایی اندازه‌ گیری کند، می‌ تواند به شدت در تأیید فرمول مولکولی پیشنهادی برای ماده شما کمک‌ کننده باشد.

 

ت) یون‌ های قطعه (سرنخ‌ هایی از ساختار مولکول)

گاهی اوقات، مولکول‌ ها در دستگاه MS به قطعات کوچکتری شکسته می‌ شوند. این “یون‌ های حاصل از شکست” یا “یون‌ های قطعه” (Fragment Ions) نیز در طیف جرمی اولیه دیده می‌ شوند و می‌ توانند سرنخ‌ های اولیه‌ ای درباره ساختار داخلی و نحوه اتصال اتم‌ ها در مولکول به ما بدهند. در روش پیشرفته‌ تری به نام MS/MS (طیف‌ سنجی جرمی متوالی)، مولکول اصلی به طور هدفمند و کنترل‌ شده شکسته شده و الگوی شکست آن به دقت بررسی می‌ شود تا اطلاعات ساختاری بسیار بیشتری به دست آید. جهت کسب اطلاعات بیشتر و مطالعه راهنمای ضروری کار با دستگاه LC-MS/MS و اجزای آن کلیک کنید!

 

۳. فرآیند کلی تفسیر (کنارهم چیدن قطعات پازل)

تفسیر داده‌ های LC-MS مانند حل کردن یک پازل جذاب است که هر قطعه از اطلاعات به دست آمده، بخشی از تصویر نهایی را برای ما روشن می‌ کند:

• شروع با کروماتوگرام LC

ابتدا به سراغ نمودار کروماتوگرافی بروید و پیک‌ های مهم و به خوبی جدا شده را شناسایی کنید.

 

• بررسی طیف جرمی MS برای هر پیک LC

  • به دنبال یون اصلی بگردید (یونی که نماینده مولکول کامل است، مانند “مولکول به همراه یک پروتون اضافه شده”) تا بتوانید وزن مولکولی ماده را به دست آورید.
  • الگوی ایزوتوپی آن یون را به دقت بررسی کنید. آیا نشانه‌ ای از حضور عناصر خاصی در آن می‌ بینید؟
  • به دنبال یون‌ های ادکت احتمالی باشید.

 

• استفاده از جرم دقیق (اگر دستگاه شما با دقت بالا کار می‌ کند…)

اگر دستگاه شما جرم یون‌ ها را با دقت بسیار بالایی اندازه‌ گیری می‌ کند، می‌ توانید از این اطلاعات برای پیشنهاد فرمول‌ های مولکولی احتمالی برای ماده خود استفاده کنید.

 

• تحلیل قطعات (اگر داده MS/MS در اختیار دارید!)

الگوی شکست یون اصلی و یون‌ های قطعه حاصل از آن را بررسی کنید تا اطلاعاتی درباره ساختار داخلی مولکول به دست آورید.

 

• مقایسه با پایگاه‌ های داده و نمونه‌ های استاندارد

در نهایت، اطلاعاتی که از تفسیر طیف به دست آورده‌ اید را می‌ توانید با کتابخانه‌ های طیفی موجود یا با آنالیز یک نمونه استاندارد مقایسه کنید تا شناسایی شما تأیید شود.

 

• برای اندازه‌ گیری مقدار

اگر هدف شما علاوه بر شناسایی، اندازه‌ گیری مقدار یک ماده خاص نیز باشد، معمولا از سطح زیر پیک مربوط به آن ماده در نمودار کروماتوگرام استفاده می‌ شود.

 

خلاصه و نتیجه مقاله

تفسیر طیف LC-MS مهارتی است که با تمرین و کسب تجربه، روز به روز بهتر می‌ شود. هر طیف LC-MS، داستانی منحصربه‌ فرد از یک یا چند مولکول را برای ما روایت می‌ کند. با یادگیری زبان این طیف‌ ها و با ترکیب هوشمندانه تمام سرنخ‌ های موجود، می‌ توانید با اطمینان و دقت بیشتری به شناسایی و درک ماهیت مواد مختلف بپردازید. خوشبختانه، نرم‌ افزارهای پیشرفته امروزی نیز به عنوان دستیاران هوشمند، کمک بسیار زیادی در پردازش، تحلیل و تفسیر این داده‌ های پیچیده به ما می‌ کنند.

 

جهت اطلاع از موجودی کالاها و قیمت ها با مشاورین فروش شرکت تجهیزات آزمایشگاهی مهام آزما ۰۲۱۸۸۵۰۹۳۸۴ – ۰۲۱۸۶۰۴۵۸۷۰ در ارتباط باشید.