شرکت مهام آزما وارد کننده و تولید کننده تجهیزات آزمایشگاهی

۰۲۱-۸۸۵۰۹۳۸۴
تجهیزات آزمایشگاهی مهام آزما

کروماتوگراف مایع HPLC

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) دستگاه کروماتوگرافی مایع
یکی از پرکاربردترین روش‌های کروماتوگرافی است. فرآیند کروماتوگرافی به‌عنوان یک روش جداسازی که شامل انتقال جرم بین یک فاز ساکن و یک فاز متحرک است، تعریف می‌شود. روش HPLC با بهره‌گیری از یک فاز متحرک مایع، ترکیبات یک مخلوط را روی فاز ساکن جدا می‌کند. فاز ساکن می‌تواند مایع یا جامد باشد. ترکیبات ابتدا در یک حلال حل می‌شوند. سپس درون یک ستون کروماتوگرافی تحت فشار بالا جریان می‌یابند. در ستون، ترکیبات مخلوط از هم جدا می‌شوند.
میزان تفکیک‌پذیری بسیار اهمیت دارد و به میزان برهم‌کنش بین ترکیبات حل شده و فاز ساکن بستگی دارد. فاز ساکن به‌عنوان مواد متراکم شده درون ستون تعریف می‌شود. برهم‌کنش جسم حل شده با فازهای متحرک و ثابت می‌تواند از طریق انتخاب حلال‌ها و فازهای ساکن مختلف تغییر کند. در نتیجه HPLC درجه بالایی از جداسازی را که در دیگر روش‌های کروماتوگرافی یافت نمی‌شود، فراهم می‌کند و توان آن را دارد تا به آسانی گستره وسیعی از مخلوط‌های شیمیایی را جدا نماید.
HPLC  یک فرآیند جذب سطحی پویا است. مولکول‌های مورد تجزیه، زمانی که از میان دانه‌های متراکم متخلخل حرکت می‌کنند، جذب سطحی می‌شوند. بسته به روش HPLC، انواع مختلفی از نیروهای جذب سطحی ممکن است در فرآیند بازداری موثر باشند. برهم‌کنش‌های آبگریز (غیراختصاصی)، اصلی‌ترین برهم‌کنش‌ها در جداسازی فاز معکوس، برهم‌کنش‌های دوقطبی-دوقطبی (قطبی)، اصلی‌ترین برهم‌کنش در روش فاز نرمال و برهم‌کنش‌های یونی نیز در کروماتوگرافی تبادل یونی، باعث بازداری ترکیبات می‌شوند. برهم‌کنش‌های مذکور همگی در رقابت با هم عمل می‌کنند. مولکول‌های مورد تجزیه با مولکول‌های حلال شوینده، برای جذب سطحی روی مکان‌های فعال فاز ساکن رقابت می‌کنند. بنابراین هر قدر مولکول‌های مورد تجزیه، برهم‌کنش قوی‌تری با سطح داشته باشند، برهم‌کنش شوینده ضعیف‌تر بوده و ماده مورد تجزیه زمان طولانی‌تری روی سطح فاز ساکن باقی می‌ماند.کروماتوگرا-ف-مایع
مفاهیم و اجزا مورد استفاده در دستگاه HPLC
•    فاز متحرک Mobile Phase
•    فاز ثابت
•    نمونه
•    زمان بازداری Retention Time
فاز متحرک Mobile Phase
فاز متحرک در HPLC حلال و یا حلال هائی است که نمونه در پروسه پمپاژ در داخل آنها حل شده و به سمت ستون کروماتوگراف حرکت می نماید.
فاز ثابت
فاز ثابت دستگاه HPLC موادی در داخل ستون انباشته شده است که اغلب از جنس خاک دیاتومه می باشد.
نمونه
نمونه ترکیبی است اغلب مایع، که اجزای تشکیل دهنده جدا شده و مقادیر کمی و کیفی آن توسط دستگاه HPLC آنالیز می شود.
زمان بازداری Retention Time
زمان بازداری مدت زمانی است که نمونه در داخل ستون HPLC می ماند تا شسته شده و به آشکار ساز برسد.
بخش های مختلف دستگاه HPLC
•    پمپ
•    انژکتور
•    ستون
•    آشکار ساز
•    کنترل کننده
•    گازگیر
پمپ HPLC
کار پمپ دستگاه اچ پی ال سی آنچنانکه از نامش پیداست، پمپاژ حلال و یا حلال ها با فشار بسیار زیاد تا حدود 40 مگا پاسکال و یا بیشتر به سمت ستون کروماتوگرافی است. این واحد معمولا از یک تا چهار حلال را به سمت ستون پمپاژ می نماید که بسته به متدهای کاری تغییر می کند. در مواقعی که از یک حلال در دستگاه HPLC استفاده می شود به آن اصطلاحا ایزوکراتیک یا تک حلاله گفته می شود. در مواقعی نیاز هست تا از ترکیب ثابت دو یا چند حلال و یا ترکیب متغیر با زمان (برنامه زمانی) استفاده شود که به این سیستم باینری و یا کواترنری یا چند حلاله و یا گرادیانت می گویند. سیستم های باینری معمولا از سرهم بندی یا کوپلینگ 2 پمپ همزمان ساخته می شوند و در مواقعی با استفاده از یک سیستم شیر چهار مسیره قابل کنترل با کامپیوتر که به ورودی پمپ متصل شده می توان از ترکیب ثابت و یا متغیر با زمان همه حلال ها استفاده نمود.کروماتوگراف-مایع
انژکتور HPLC
انژکتور و یا Injector در واقع نقش تزریق کننده نمونه مورد آنالیز به داخل حلال عبوری را در دستگاه کروماتوگراف مایع بازی می کند. این بخش سیستمی است متشکل از چند مسیر که می تواند بین پمپ و ستون قرار گرفته و بتواند در حین عبور حلال یا فاز حامل با فشار زیاد مقدار معینی از نمونه را به داخل آن هدایت نماید. مقدار ثابت نمونه در داخل لوله ای باحجم مشخص بنام لوپ در کمین نشسته تا در لحظه فرمان کاربر سوار موج حلال شده و به سمت ستون کروماتوگرافی حرکت نماید. انژکتور اتوماتیک و یا Autosampler نیز نوع رباتیک این سیتم می باشد که می تواند تعداد بسیار زیادی از نمونه را طبق برنامه داده شده کاربر به داخل حلال تزریق نماید
ستون HPLC
طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانل و بعد با متانل خالص شستشو مي دهيم. فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است. كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود، گارد كالوم را پس از مدتي بايد عوض كرد، ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست.
اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و حلال قطبي باشد. سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.کروماتوگراف مایع
انواع ستون در hplc
•    ستون های کروماتوگرافی مایع
•    ستون های تجزیه ای
•    ستون های محافظ

آشکار ساز یا Detector
دتکتور دستگاهی است که بنا بر خاصیتی مثل میزان جذب می تواند غلظت نمونه را دستگاه کروماتوگراف مایع بسنجد. در بیشتر موارد دتکتور کروماتوگراف یک سیستم اسپکتروفتومتر است که در طول موج خاصی می تواند مقدار و نوع نمونه را نمایش دهد و این دتکتور SPD نامیده می شود. از دیگر دتکتورهای کروماتوگراف می توان از دتکتور RID نام برد که بر اساس ضریب شکست نمونه آن را شناسائی و مقدارسنجی می نماید. دتکتور RF، براساس میزان فلورسانس نمونه. دتکتور MS براساس جرم مولکولی.
کنترلر Controller
کنترلر در دستگاه کروماتوگراف مایع بخشی است که ماژولهای دیگر را کنترل نموده و ارتباط همه بخشها و کامپیوتر را برقرار می نماید. در پایان اطلاعات اجزای ترکیب بصورت نمودار یا اصطلاحاً کروماتوگراف روی نمایشگر قابل دستیابی است.
دگسر Degasser
قبل از ورود حلال به داخل پمپ در دستگاه HPLC، باید هرگونه حباب هوا و یا گاز دیگر و یا هوای حل شده در حلال از آن زدوده شود. این کار به دو روش تزریق گاز بی اثر مثل آرگون در داخل حلال در حین لرزاندن حلال و دیگری استفاده از دستگاه گازگیر یا دگسر صورت می گیرد. امروزه در دستگاه HPLC بیشتر از دستگاه Degasser استفاده می شود که سیستم نیمه تراوای داخل آن گاز را تراوش نموده ولی اجازه خروج مایع را نمی دهد.
از دیگر بخشهای یک سیستم HPLC می توان به بخش کنترل کننده دمای ستون یا همان آون ستون اشاره نمود. یکی دیگر از بخش ها ی این تجهیز، Mixer است که حلال ها و نمونه را قبل از تزریق به ستون بصورت همگن مخلوط می نماید.
تجهیزات جانبی HPLC شامل موارد زیر می باشد
•    ستونهای کاپیلاری و ستونهای استیل Packed
•    ستونهای HPLC
•    سپتومهای مختلف دستگاههای گازکروماتوگراف
•    سرنگ های کروماتوگرافی – سرنگهای گازی و……..
•    فرول گرافیتی ستون کاپیلاری- لاینر – گاز پیوریفایر تراپ – فرول گرافیتی ستون Packed
•    ژنراتور گاز هیدروژن – ژنراتور گازازت و ژنراتور گازهوا
•    مولتی ژنراتور گاز (تولید هیدروژن،ازت و هوا در یک دستگاه)
•    کمپرسور هوا بدون روغن
•    لوله های رابط – مهره اتصال گازها – رگلاتور گاز
•    سیلندر گازهای هوا – ازت – هیدروژن با خلوص بالا

کاربردهای HPLC
کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ، زمینه‌های مختلف علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند. مثال‌هایی از این موارد عبارت‌اند از : اسیدهای آمینه ، پروتئین‌ها ، اسیدهای نوکلئیک ، هیدروکربنها ، هیدراتهای کربن ، داروها ، ترپنوئیدها، حشره‌کش‌ها ، آنتی‌بیوتیکها ، استروئیدها ، گونه‌های آلی و گروهی از مواد گوناگون معدنی
توصيه‌هاي لازم در زمینه خرید دستگاه hplc
سيستم HPLC متشكل از مدول‌هاي مختلف است كه خريداران مي‌توانند از بين آن‌ها بر‌اساس نيازهاي خود انتخاب كنند. به عنوان مثال، اگر تنها تعداد كمي نمونه به صورت روزانه آناليز مي‌شود، ممكن است انژكتور دستي كافي باشد. به علاوه دتكتورهاي متفاوتي براي آناليت‌هاي بيولوژيكي مختلف، مناسب اند. اغلب توليدكنندگان سيستم را براي خريدار به صورت سفارشي تنظيم مي‌كنند.
ممكن است در برخي كاربردهاي باليني، نياز باشد كه اين دستگاه‌ها تاييديه ي FDA براي كاربردهاي in vitro داشته باشند. توليدكنندگاني كه دستگاه‌هايشان اين كاربردها را دارند مي‌توانند مدارك مربوطه را در اختيار كاربران قرار دهند.
قبـل از خـريـد سيستـم HPLC خـريـداران بـايـد تعيين كنند كه آيا سازنده سيستم، تمام ستون‌هاي جايگزين و تداركات موردنياز را مي‌فروشد. اگر سازنده اين آيتم‌ها را نفروشد خـريـدار بـايـد بداند كه چه انواعي با دستگاه اين توليدكننده سازگارند و از كجا بايد آن‌ها را تامين كند. برخي از تامين كنندگان، در صورت خريد عمده، تخفيف قابل توجهي در مورد معرف‌ها و ديگر تداركات ارائه مي‌كنند.
مـواد مصـرفـي بخـش عمـده اي از هـزينـه‌هاي عـمـلـكــردي را تـشـكـيــل مــي‌دهـنــد و ايــن هــزيـنـه مـي‌تـواند بسته به تخفيف‌هاي ارائه شده توسط تامين كننده، تا حد زيادي تغيير كند.
يك مساله ي مهم در مورد سيستم‌هاي HPLC، ارتباط آن‌ها با كامپيوتر است. برقراري يك ارتباط مـوثـر بـا سـيـسـتم اطلاعات آزمايشگاهي (LIS) يا سـيـسـتــم كــامـيـپــوتـري مـركـزي بـراي وارد كـردن داده‌هاي تست، ارزيابي صحت تست، حفظ QC، كاليبره كردن، تست‌هاي كارائي و فايل‌هاي بيمار طبق رهنمودهاي CLIAضروري است

.